Los miofibroblastos LRRC15+ dictan el punto de ajuste del estroma para suprimir la inmunidad tumoral

Jun 24, 2023

Nature volumen 611, páginas 148–154 (2022)Citar este artículo

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Recientes estudios unicelulares de cáncer tanto en ratones como en humanos han identificado la aparición de una población de miofibroblastos específicamente marcada por la proteína 15 (LRRC15)1,2,3 que contiene repeticiones ricas en leucina altamente restringida. Sin embargo, las señales moleculares que subyacen al desarrollo de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) LRRC15+ y su impacto directo en la inmunidad antitumoral no están caracterizadas. Aquí, en modelos de ratón de cáncer de páncreas, proporcionamos evidencia genética in vivo de que la señalización del receptor TGFβ tipo 2 en fibroblastos universales dermatopontina+ sanos es esencial para el desarrollo de miofibroblastos LRRC15+ asociados con el cáncer. Este eje también impulsa predominantemente la diversidad del linaje de fibroblastos en los cánceres humanos. Usando ratones knock-in para receptores de toxina diftérica Lrrc15 recientemente desarrollados para agotar selectivamente los CAF LRRC15 +, mostramos que el agotamiento de esta población reduce notablemente el contenido total de fibroblastos tumorales. Además, la composición de CAF se recalibra hacia fibroblastos universales. Esto alivia la supresión directa de las células T CD8+ que infiltran el tumor para mejorar su función efectora y aumenta la regresión del tumor en respuesta al bloqueo del punto de control inmunitario anti-PDL1. En conjunto, estos hallazgos demuestran que los CAF LRRC15+ dependientes de TGFβ dictan el punto de referencia tumor-fibroblasto para promover el crecimiento tumoral. Estas células también suprimen directamente la función de las células T CD8+ y limitan la capacidad de respuesta al bloqueo del punto de control. El desarrollo de tratamientos que restablezcan el punto de referencia de los fibroblastos homeostáticos mediante la reducción de la población de miofibroblastos LRRC15+ pro-enfermedad puede mejorar la supervivencia del paciente y la respuesta a la inmunoterapia.

Los CAF juegan un papel clave en la configuración del microambiente tumoral (TME) y la respuesta a la inmunoterapia contra el cáncer4,5,6. Estudios previos de datos de expresión génica de tumores de pacientes que recibieron terapias de bloqueo del punto de control inmunitario (ICB) han inferido una asociación entre la abundancia de CAF y la falta de respuesta a la inmunoterapia7,8. Los agentes terapéuticos que se dirigen adecuadamente a los CAF pueden aliviar esta resistencia, pero siguen siendo limitados debido a una comprensión incompleta de la heterogeneidad de los CAF y la identificación de subconjuntos clínicamente relevantes. El uso de la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) ha aumentado la resolución del paisaje de células del estroma en tejidos sanos y enfermos. Los análisis de scRNA-seq de la evolución de CAF en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) y el cáncer de mama han identificado un predominio de miofibroblastos activados (tanto en ratones como en humanos) marcados por LRRC15 (refs 1,2,3). Esta población de CAF expresa multitud de genes asociados a la matriz extracelular ya la inmunosupresión1,9,10. Clínicamente, la alta expresión de una firma del gen LRRC15+ CAF en datos de secuencias de ARN a granel de pacientes con cáncer se asoció con una falta de respuesta al ligando 1 de muerte programada (PDL1) ICB1. No está claro si los CAF LRRC15+ son la base de esta falta de respuesta o si representan una lectura de las características intrínsecas del tumor que impulsan la asociación. También falta la confirmación in vivo de las señales celulares y moleculares que promueven el desarrollo de miofibroblastos LRRC15+ y su impacto directo en la inmunidad antitumoral.

Estudios recientes de scRNA-seq utilizaron predicciones in silico para asociar la señalización activa de TGFβ con la formación de miofibroblastos LRRC15+ durante la tumorigénesis1,3. Estudios de atlas unicelulares separados han inferido que los subconjuntos de fibroblastos activados en tejidos perturbados se desarrollan a partir de fibroblastos universales de pan-tejido10. Nuestro objetivo fue proporcionar un vínculo genético in vivo entre estas dos inferencias, proponiendo que la señalización de TGFβ en fibroblastos universales es indispensable para la formación de miofibroblastos LRRC15+ durante la progresión tumoral. Utilizamos un sistema de ratón que se dirige a la dermatopontina (DPT), una proteína de matriz extracelular que marca los fibroblastos universales10. Los ratones DptIresCreERT2 se cruzaron con el receptor TGFβ tipo 2 (TGFβR2, codificado por Tgfbr2) ratones floxed (DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl) para generar un knockout inducible y condicional de Tgfbr2 en fibroblastos universales DPT+ (Fig. 1a, arriba). Los ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl (control) o Dptki/kiTgfbr2fl/fl (Dpt-knockout condicional) se sometieron a un régimen de tamoxifeno (TAM) y se les implantó por vía subcutánea KPR3070 (KPR; KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt; p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre) células tumorales PDAC1,11. Los tumores se recolectaron 21 días después de la implantación para el análisis de citometría de flujo (Fig. 1a, abajo). Para garantizar la desactivación eficiente de Tgfbr2, el mismo régimen TAM (descrito en la Fig. 1a) se realizó por primera vez en ratones informadores DptIresCreERT2Rosa26LSLYFP10 que tenían tumores KPR subcutáneos. Esto se hizo para entender qué proporción de fibroblastos tumorales se derivan de células DPT+, una población de fibroblastos abundante en tejido cutáneo ingenuo10. Después de 21 días de implantación, la mayoría (alrededor del 84 %) de los fibroblastos PDPN+ en los tumores eran YFP+ (Datos ampliados, Fig. 1a). A su vez, la expresión de TGFβR2 en PDPN+ CAF de tumores Dptki/kiTgfbr2fl/fl se redujo en aproximadamente un 90 % en comparación con los tumores Dptwt/wtTgfbr2fl/fl (datos ampliados, figura 1b). Como resultado, los tumores Dptki/kiTgfbr2fl/fl tuvieron una reducción significativa en el número total de CAF LRRC15+PDPN+ en comparación con los tumores Dptwt/wtTgfbr2fl/fl de control, lo que indicó que las células LRRC15+ dependen de la señalización de TGFβR2 en las células DPT+ para su formación (Fig. 1b,c). A pesar de la reducción significativa de células LRRC15+ en los tumores Dptki/kiTgfbr2fl/fl, el número total de fibroblastos PDPN+CD31– no cambió entre ambos grupos, lo que indica que se produjo un mecanismo de compensación para mantener el compartimento CAF (Fig. 1d).

a, Esquema del enfoque genético (arriba) y experimental (abajo) para la generación de ratones DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl. SC, subcutáneo. b–g, los datos son de tumores KPR subcutáneos 21 días después de la implantación en ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl y Dptki/kiTgfbr2fl/fl. b, Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la frecuencia de células PDPN+LRRC15+. Las células se bloquearon en células PDPN+CD31–. c, d, Cuantificación del número total de células PDPN+LRRC15+ (c) y células PDPN+CD31– (d) normalizadas por el peso del tumor (n = 12 ratones). e, Gráfica de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP) de 6525 fibroblastos individuales coloreados por pertenencia al grupo (izquierda, n = 5 ratones por grupo) y la expresión promedio relativa de los genes marcadores indicados en grupos (C0–C5) del UMAP (derecha ). f, UMAP como en e dividido por genotipo. g, UMAP como en e dividido por genotipo y coloreado por expresión de Lrrc15. h–j, Los datos son de tumores KPR pancreáticos ortotópicos 15 días después de la implantación en ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl o Dptki/kiTgfbr2fl/fl h, Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la frecuencia de células PDPN+LRRC15+. Las células se bloquearon en células PDPN+CD31–. i,j, Cuantificación del número total de células PDPN+LRRC15+ (i) y células PDPN+CD31– (j) normalizadas por el peso del tumor (n = 11 o 14 ratones). k, Esquema de recogida de las muestras humanas. NAT, tejido adyacente normal; BLAD, carcinoma urotelial vesical; GYN, tumores ginecológicos; PDAC, adenocarcinoma ductal pancreático; HNSC, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; SRC, sarcoma; NIÑO, cáncer de riñón; HEP, carcinoma hepatocelular hepático; CCR, cáncer colorrectal; PULMÓN, cáncer de pulmón; MEL, melanoma; ADR, cáncer suprarrenal; PNET, tumor neuroendocrino pancreático; BALL, cáncer de vesícula biliar. l, PCA de muestras de células del estroma. Las formas indican el origen de la muestra; los colores representan la indicación de cáncer. m, Cargas de genes para PC1 de l. n, Distribución de muestras de indicaciones específicas a través de PC1 desde l. o, coeficiente de correlación de Pearson (PCC) entre la expresión de LRRC15 y la actividad de la ruta de TGFβ en las muestras (círculos rellenos). Línea de regresión lineal (línea discontinua). p, Diagrama de bosque que representa los cocientes de riesgo de supervivencia (HR) generales de TGFβ CAF en las indicaciones TCGA especificadas. Los datos en c, d, iyj son la media ± sd Los datos en c, d, iyj se agrupan a partir de dos o tres experimentos independientes. Para n, los bigotes representan el mínimo y el máximo, el cuadro representa el rango intercuartílico y la línea central representa la mediana. Para p, el punto central muestra la HR, las líneas representan el intervalo de confianza (IC) del 95 %. Las estadísticas se calcularon utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas (c, d, i, j) o el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox (p).

Datos fuente

El mantenimiento del contenido total de fibroblastos en ausencia de formación de LRRC15+ CAF en tumores Dptki/kiTgfbr2fl/fl justificaba una investigación más profunda de la composición de fibroblastos en estos ratones. scRNA-seq se realizó en células estromales CD24–CD45– y células inmunitarias CD45+ de tumores Dptwt/wtTgfbr2fl/fl y Dptki/kiTgfbr2fl/fl (Datos ampliados, Fig. 1c). Después del control de calidad, la reducción de la dimensionalidad y la agrupación, cuatro grupos principales de células fueron identificadas, cada una representada por células de múltiples animales (Datos extendidos Fig. 1d). Estas eran células inmunitarias (Ptprc+, también conocidas como Cd45+), células endoteliales (Pecam1+, también conocidas como Cd31+), pericitos (Rgs5+) y fibroblastos (Lum+) (Tabla complementaria 1). Centrar nuestro análisis posterior en fibroblastos reveló seis grupos específicos de CAF (Fig. 1e y Tabla complementaria 2): un grupo Pi16 + que expresó fuertemente marcadores de fibroblastos universales (grupo 3); un grupo Cxcl12+ (grupo 2); un grupo de CAF Crabp1+ (grupo 1); un grupo que expresó altamente marcadores de proliferación (grupo 4); y dos grupos con expresión Lrrc15 alta (grupo 0) y baja (grupo 5) (Fig. 1e). Los grupos 0 y 5 expresaron marcadores de miofibroblastos adicionales más allá de Lrrc15, indicativos de la señalización de TGFβ, como Acta2 y Tagln. Estos dos grupos también obtuvieron una puntuación alta para una firma del gen Tgfb CAF inferida previamente de modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) de PDAC1 (Datos extendidos Fig. 1e). Confirmando nuestra hipótesis de que la señalización de TGFβR2 en las células DPT+ es necesaria para el desarrollo de CAF LRRC15+, los grupos 5 y 0 estaban ausentes en los ratones Dptki/kiTgfbr2fl/fl (Fig. 1f). Además, los animales Dptki/kiTgfbr2fl/fl casi no tenían células que expresaran Lrrc15, Acta2 o Tagln (Fig. 1g y Extended Data Fig. 1f). La falta de CAF LRRC15+ resultó en un aumento concomitante en la abundancia relativa del grupo 3 de fibroblastos universales Pi16+ y el grupo 1 de Crabp1+ en ratones Dptki/kiTgfbr2fl/fl. Este resultado corrobora nuestros hallazgos de que el contenido total de fibroblastos tumorales se compensa en ausencia de desarrollo de CAF LRRC15 + (Datos extendidos Fig. 1g, h). No se observaron cambios significativos en la abundancia relativa del grupo 4 en proliferación, pero las células en proliferación de los ratones Dptki/kiTgfbr2fl/fl obtuvieron una puntuación baja para la firma Tgfb CAF PDAC GEMM. Por el contrario, las células de animales Dptwt/wtTgfbr2fl/fl obtuvieron una puntuación alta para esta firma, lo que está en línea con nuestro hallazgo de que la formación de LRRC15+ CAF a partir de fibroblastos universales DPT+ depende de TGFβR2 (datos extendidos Fig. 1i).

A continuación, preguntamos si se requiere la misma activación de la vía para el desarrollo de CAF LRRC15+ en el páncreas, un sitio de tejido con una abundancia similar de fibroblastos universales DPT+ en estado estacionario10. Se implantaron ortotópicamente células tumorales KPR en el páncreas de ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl o Dptki/kiTgfbr2fl/fl, y los tumores se analizaron 15 días después (Fig. 1a, abajo). De manera similar a los tumores KPR subcutáneos, el desarrollo de CAF LRRC15+PDPN+ en tumores pancreáticos ortotópicos se vio significativamente afectado en ratones Dptki/kiTgfbr2fl/fl en comparación con ratones control Dptwt/wtTgfbr2fl/fl, mientras que el número total de fibroblastos PDPN+CD31– permaneció sin cambios (Fig. .1h–j).

Estos datos proporcionan evidencia directa in vivo de que se requiere la señalización de TGFβ para la diferenciación de fibroblastos universales DPT+ en miofibroblastos LRRC15+. La reducción del desarrollo de CAF LRRC15+ resultó en una acumulación de fibroblastos universales DPT+ y CAF independientes de TGFβR2 para mantener el compartimento CAF en su ausencia. Es importante destacar que esta relación de linaje y dependencia de señalización se requería en múltiples sitios de tejido, lo que confirma la naturaleza universal de los fibroblastos DPT+.

A continuación, nuestro objetivo era comprender si el eje entre los fibroblastos universales y los miofibroblastos LRRC15+ era representativo del compartimento de fibroblastos en los cánceres humanos. Estudios anteriores1 se basaron en la deconvolución de datos de secuenciación de ARN a granel de muestras de tumores completos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) para inferir la abundancia de un subconjunto específico de CAF en todas las indicaciones. Para centrarnos específicamente en la heterogeneidad dentro del compartimento de fibroblastos en los tipos de cáncer humano, clasificamos las células estromales CD45–CD44+CD90+ de 159 muestras de pacientes en 13 indicaciones (Fig. 1k y Tabla complementaria 3) y generamos perfiles de expresión de ARN-seq a granel. El filtrado de muestras de alta pureza sobre la base del análisis de componentes principales (PCA) y el agrupamiento jerárquico permitió una visión imparcial de los programas de expresión de CAF humanos y su prevalencia de pancáncer (Datos ampliados, Fig. 2a). No observamos una separación clara de las indicaciones de cáncer en el espacio PCA, lo que sugirió que las firmas de células estromales pancancerosas estaban impulsando los dos primeros componentes principales (PC) (Fig. 1l). Los genes con los pesos positivos más fuertes para PC1 comprendían genes marcadores de expresión de LRRC15+ CAF conocidos, como COL10A1, COL11A1, MMP11 y LRRC15 (ref. 1). Por el contrario, los marcadores asociados con los fibroblastos universales descritos anteriormente, como CD34 y PI16, tenían los pesos negativos más fuertes para PC1 (ref. 10) (Fig. 1m). De manera consistente, las muestras obtenidas de tejido adyacente normal exhibieron valores de PC1 en su mayoría negativos (Datos extendidos Fig. 2b). Entre las indicaciones analizadas, las muestras de cáncer de páncreas y cáncer de vejiga tenían los valores de PC1 más altos, lo que indicaba un fuerte enriquecimiento de CAF LRRC15+ (Fig. 1n). La tendencia de niveles altos de LRRC15+ CAF en el cáncer de páncreas se confirmó en un conjunto de datos independiente (Datos ampliados, Fig. 2c). El análisis de enriquecimiento de la ruta reveló que las muestras con altos niveles de expresión de LRRC15 mostraron una mayor activación de la ruta de TGFβ, lo que sugiere fuertemente que el programa de expresión de LRRC15+ CAF en humanos, como se demostró genéticamente en nuestro modelo de ratón, está impulsado de manera similar por la señalización de TGFβ (Fig. 1o). Los altos niveles de expresión de los marcadores TGFβ CAF se asociaron significativamente con una peor supervivencia en muestras de todas las indicaciones en TCGA y dentro de ciertos tipos de tumores, incluido el cáncer de vejiga y el cáncer de páncreas (Fig. 1p y Datos extendidos Fig. 2d). Estos datos humanos revelan un eje central de heterogeneidad de CAF en los cánceres humanos definidos por fibroblastos universales y miofibroblastos LRRC15+, con señalización de TGFβ enriquecida en indicaciones en las que abundan los CAF LRRC15+.

Junto con los resultados de nuestro sistema genético de ratón, estos hallazgos sugieren que la señalización de TGFβ actúa como un reóstato para dictar el punto de ajuste de fibroblastos tumorales entre fibroblastos universales y miofibroblastos LRRC15+ y puede servir como un predictor potencial del resultado del paciente.

Para investigar el impacto de los CAF LRRC15+ en el crecimiento tumoral y la inmunidad antitumoral, se generó un modelo genético de ratón en el que un casete de receptor de toxina diftérica (DTR)-GFP se colocó en el exón 2, aguas abajo del codón de inicio de Lrrc15 (Lrrc15DTRGFP knock- en ratones). Este modelo permitió el agotamiento controlado de las células que expresan LRRC15 luego de la administración de la toxina diftérica (DT) (Fig. 2a, arriba). Para garantizar que este enfoque proporcione la ablación selectiva de esta subpoblación de CAF, evaluamos la expresión de LRRC15 en ratones. Dentro de los tumores KPR, la expresión de LRRC15 estaba restringida a fibroblastos PDPN+ y en gran medida ausente en otros compartimentos (Datos ampliados, Fig. 3a). Fuera de los tumores, la hibridación in situ y el análisis de RNA-seq12 a granel mostraron que la expresión de Lrrc15 era baja o nula en múltiples tejidos (datos extendidos, Fig. 3b, c). Se han informado resultados similares en tumores humanos y tejidos periféricos13.

a, Esquema del enfoque genético (arriba) y experimental (abajo) para ratones Lrrc15DTRGFP. b–e, los datos son de tumores KPR subcutáneos 8 días después del tratamiento con DT en ratones DTR– y DTR+. b, Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la frecuencia de células PDPN+LRRC15+. Las células se bloquearon en células CD24–CD45– (izquierda) o células PDPN+CD31– (derecha). c, d, Cuantificación del número total de células PDPN+LRRC15+ (c) y células PDPN+CD31– (d) normalizadas por el peso del tumor (n = 12 o 14 ratones). e, Imágenes representativas de inmunofluorescencia de LRRC15 y DAPI. Barra de escala, 250 µm. f, Curvas de crecimiento tumoral de ratones DTR– y DTR+ tratados con DT (n = 9 u 11 ratones por grupo). Izquierda: volumen tumoral medio en todos los animales (*P = 0,015, ***P = 0,0006, ****P < 0,0001). Medio y derecho: curvas de crecimiento de animales individuales por genotipo. El eje x representa los días posteriores al tratamiento con DT. La línea roja discontinua representa el ajuste de referencia promedio para el grupo de control (Ctrl). Los datos en c y d se agrupan a partir de cuatro experimentos independientes. Los datos en e y f son representativos de dos o tres experimentos independientes. Los datos en c, d y f son la media ± sd Las estadísticas se calcularon utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas (c y d) o el análisis de varianza bidireccional ordinario (f).

Datos fuente

Como las estrategias anteriores de agotamiento de CAF han utilizado marcadores como actina de músculo liso α (αSMA, codificada por Acta2) y proteína de activación de fibroblastos (FAP, codificada por Fap)14,15, comparamos los niveles de expresión de Fap y Acta2 con Lrrc15. En los tumores KPR, la expresión de Lrrc15 se restringió a los fibroblastos, mientras que la expresión de Acta2 y Fap se observó tanto en fibroblastos como en pericitos (Datos ampliados, Fig. 3d). Más allá del tumor, se observó la expresión tanto de Fap como de Acta2 en células del estroma en múltiples tejidos, mientras que Lrrc15 estuvo ausente (Datos extendidos, Fig. 3e). En los ganglios linfáticos (LN) que drenan la piel del ratón, los pericitos expresaron mucho Acta2, y tanto la expresión de Fap como la de Acta2 se superpusieron de manera prominente con las células reticulares fibroblásticas Ccl19+. Por el contrario, Lrrc15 fue indetectable en células reticulares fibroblásticas de LN o pericitos16 (Datos extendidos, Fig. 3f). En conjunto, estos datos demuestran que LRRC15 es un marcador genuino de CAF impulsados ​​por TGFβ que no se superpone con otras células dentro y fuera de los tumores.

Dada la especificidad de la expresión de Lrrc15, procedimos a evaluar el impacto del agotamiento selectivo de CAF LRRC15+ en el crecimiento tumoral. Los tumores KPR se implantaron por vía subcutánea en ratones Lrrc15DTRGFPwt/wt (DTR–) o Lrrc15DTRGFPwt/ki (DTR+), y el tratamiento con DT se inició en ambos grupos de ratones cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 100–200 mm3 (alrededor de 10 días después de la implantación) (Fig. 2a, abajo). Ocho días después, se recogieron los tumores y se evaluó la presencia de CAF LRRC15+. Los tumores de ratones DTR- tratados con DT tenían una población predominante de CAF LRRC15+, mientras que el tratamiento con DT en tumores DTR+ resultó en una pérdida de aproximadamente el 98 % del total de células LRRC15+ (Fig. 2b,c). Es importante destacar que la pérdida de CAF LRRC15+ en ratones DTR+ fue específica del tratamiento con DT y no fue el resultado de un desarrollo insuficiente de estas células en ausencia de DT (datos extendidos, Fig. 4a,b). El número total de fibroblastos PDPN+ también se redujo significativamente en aproximadamente un 70% en ratones DTR+ tratados con DT (Fig. 2d). Las imágenes de inmunofluorescencia confirmaron estos resultados, mostrando una ausencia de tinción LRRC15 en tumores DTR+ (Fig. 2e). La administración continua de DT mantuvo una disminución significativa de CAF LRRC15+ y un compartimiento de fibroblastos PDPN+ disminuido más allá del día 8 y no causó ningún cambio significativo en el peso corporal en ninguno de los grupos de ratones (Datos extendidos Fig. 4c, d). Como resultado, el crecimiento del tumor se ralentizó significativamente después del agotamiento sostenido de CAF LRRC15+ en ratones DTR+ en comparación con ratones de control DTR– (Fig. 2f). En conjunto, estos datos muestran que la ablación selectiva del subtipo LRRC15+ de CAF en tumores conduce a una disminución significativa en el contenido total de CAF y una reducción marcada y persistente en la carga tumoral.

El impacto significativo de la ablación de LRRC15+ CAF en el compartimiento de fibroblastos nos llevó a investigar la composición del entorno restante de CAF en su ausencia. scRNA-seq de células estromales CD24–CD45– de tumores en ratones DTR– y DTR+ se llevó a cabo en 4 puntos de tiempo diferentes, incluidos 10 días después de la implantación del tumor e inmediatamente antes del inicio del tratamiento DT (IOT) (día 0) y en días 7, 14 y 21 después de IOT (Fig. 3a y Datos extendidos Fig. 5a, arriba). El tratamiento con DT se inició en todos los ratones desde el día 0 hasta el día 14 y luego se detuvo durante la última semana del estudio hasta el día 21 (Fig. 3a). Además, se caracterizaron las células estromales EPCAM–CD45–de tejido cutáneo ingenuo y sin tumor para establecer un perfil de referencia antes de la implantación del tumor (Fig. 3a y Datos extendidos Fig. 5a, abajo).

a, Esquema experimental (n = 5 ratones por punto de tiempo y grupo). b, gráfico UMAP de 37 383 fibroblastos individuales coloreados por pertenencia al grupo (izquierda) o coloreados por tejido de origen (centro). Expresión media relativa de los genes marcadores indicados en grupos de UMAP izquierda (derecha). c, UMAP como en b, coloreado por expresión de Pi16 y Lrrc15 y dividido por punto de tiempo y condición. d, Diagrama de puntos que visualiza el porcentaje de fibroblastos positivos (tamaño de punto) y la expresión promedio relativa (color) para Lrrc15 y Pi16 en cada momento y condición en muestras con tumor. e, Fracción de células en el grupo 0 de cada grupo de tratamiento (n = 5 ratones por grupo) en los cuatro puntos de tiempo en muestras que contienen tumores. f, puntajes de enriquecimiento de la vía PROGENy (color) para las células agrupadas para cada uno de los puntos de tiempo y condiciones indicados (fila inferior). Los datos en e son la media + sem, y las estadísticas se calcularon utilizando la prueba t de Student no pareada de dos colas.

Datos fuente

Después del control de calidad, se analizaron 54 240 células estromales individuales en todos los puntos de tiempo y grupos de tratamiento. La reducción de la dimensionalidad y el agrupamiento revelaron pericitos (Rgs5+), células endoteliales (Pecam1+, también conocidas como Cd31+) y fibroblastos (Lum+) como las tres principales poblaciones de células estromales (Datos extendidos Fig. 5b, izquierda e inferior, y Tabla complementaria 4). Todos los grupos se poblaron con células de múltiples animales, y los análisis posteriores se centraron en los fibroblastos (Datos extendidos Fig. 5b, derecha y Tabla complementaria 5). Los fibroblastos de tejido de piel virgen formaron dos grupos separados (grupos 3 y 4) con poca o ninguna mezcla de células de ratones portadores de tumores (Fig. 3b). Dentro del tejido con tumor, los fibroblastos podrían asignarse a cuatro fenotipos de expresión transcripcional: un grupo Lrrc15 (grupo 0) que también expresaba marcadores de miofibroblastos como Tagln y Spp1; un grupo de CAF en proliferación (grupo 5); un grupo de CAF que expresan Cxcl14 (grupo 2); y un grupo de CAF Pi16high (grupo 1) que compartían patrones de expresión con fibroblastos universales10 (Fig. 3b).

Luego se controló la dinámica de fibroblastos en ratones DTR– y DTR+ tratados con DT, y se comparó la expresión de Pi16 y Lrrc15 en cada punto de tiempo (Fig. 3c). En piel sin tratar, sin tumor, la expresión de Lrrc15 estaba ausente y todas las células eran uniformemente Pi16+. Este resultado indicó un fenotipo de fibroblastos universal similar al de los fibroblastos de tejido pancreático normales1,10. En tejido tumoral, el día 0, se detectaron células Pi16+ y células Lrrc15+. En los animales DTR–, los CAF LRRC15+ surgieron como la población CAF dominante a lo largo del tiempo, comenzando en el día 7 y persistiendo hasta el día 21 (Fig. 3c, d). Por el contrario, en los animales DTR+, las células Lrrc15+ estuvieron ausentes durante las primeras 2 semanas de tratamiento con DT, y se observó un aumento relativo concomitante en las células Pi16+, de las cuales un subconjunto también expresó Cxcl12 (Fig. 3c, d y Datos extendidos Fig. 5c ). El día 21, 1 semana después del cese del tratamiento con DT, resurgieron las células Lrrc15+ (Fig. 3c, d). Este mismo patrón de cinética de Lrrc15 se reflejó en el nivel de grupo, en el que la frecuencia de células del grupo 0 de LRRC15+ CAF aumentó y se mantuvo en animales DTR–. Por el contrario, los animales DTR+ se agotaron de los CAF del grupo 0 antes de resurgir después de la eliminación de DT (Fig. 3e). Las frecuencias relativas de los grupos 1, 2 y 5 asociados al tumor también aumentaron en los animales DTR+ (Datos extendidos Fig. 5d). La expresión de Pi16 parcialmente retenida por los CAF de los grupos 1, 2 y 5 sugirió que se encuentran en un estado que es más similar a los fibroblastos tisulares normales. En apoyo de esta observación, los grupos 1 y 2 puntuaron más alto para una firma de fibroblastos de piel normal de los grupos 3 y 4 que para los grupos 0 y 5 (Datos extendidos Fig. 5e).

El análisis de actividad de la ruta PROGENy17 reveló una alta actividad de TGFβ en muestras en las que estaban presentes CAF LRRC15+. Por el contrario, las muestras en las que se agotaron los CAF LRRC15 + fueron más similares a las muestras de fibroblastos de piel virgen y enriquecidas para las vías de señalización JAK-STAT, NF-κB y TNF (Fig. 3f). Esto se explicó en gran medida por los cambios mencionados anteriormente en la abundancia de grupos, en los que los grupos 1 y 2 compartían las vías de señalización JAK-STAT, NF-κB y TNF con fibroblastos de tejido normal (grupos 3 y 4) en comparación con el grupo 0, que tenía la mayor actividad de TGFβ. (Datos extendidos Fig. 5f). Juntos, estos datos indican que el agotamiento de los CAF LRRC15+ no solo reduce el contenido general de fibroblastos en los tumores KPR, sino que también recalibra el punto de ajuste de los CAF restantes hacia un estado similar al de los fibroblastos más universal.

Estudios recientes han identificado una asociación clínica entre la alta expresión de una firma LRRC15+ CAF y la falta de respuesta al tratamiento anti-PDL1 en múltiples tipos de cáncer1,2. Sin embargo, aún no se ha probado si los CAF LRRC15+ son la causa directa de esta asociación. Propusimos que la inmunidad de las células T y la capacidad de respuesta de ICB se verían afectadas en ausencia de CAF LRRC15+ y probamos esto en nuestro modelo preclínico. En primer lugar, determinamos si el control tumoral mejorado observado después de la ablación de LRRC15+ CAF depende de las células T CD8+. Con este fin, a los ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR subcutáneos y tratados con DT también se les administró un anticuerpo de control de isotipo o de reducción de CD8. El crecimiento del tumor se controló durante el transcurso del tratamiento (Fig. 4a). Los ratones en los que se agotaron los CAF LRRC15+ exhibieron una carga tumoral significativamente reducida en comparación con los ratones con suficientes CAF LRRC15+ (Fig. 4b y Datos extendidos, Fig. 6a). El agotamiento de las células T CD8 revirtió este efecto, lo que indicó que las células T CD8+ tienen un papel en la reducción de la carga tumoral en ausencia de CAF LRRC15+ (Fig. 4b y Datos ampliados Fig. 6a).

a,b, Los datos provienen de ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR subcutáneos tratados con DT y un anticuerpo que reduce las CD8. a, Esquema experimental. b, Curvas de crecimiento tumoral promedio (n = 10 ratones por grupo; *** P = 0,0002, **** P < 0,0001). c–e, análisis de tumor KPR subcutáneo el día 12 después del tratamiento con DT en ratones DTR– y DTR+. c, Cuantificación de células T CD8+ normalizadas por peso tumoral (n = 10 ratones). d, Cuantificación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) de TIM3, LAG3 y CD39 en células T CD8+PD1+ (n = 5 ratones). e, Cuantificación de la frecuencia de células T CD8+ TNF+ e IFNγ+ (n = 10 ratones). f, Cuantificación de la frecuencia de TNF+ e IFNγ+ de células T CD8+ activadas con anti-CD3 y anti-CD28 después de 72 h de cultivo solo o con CAF clasificados (L15, LRRC15; n = 4 muestras). g–j, los datos son de ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR subcutáneos tratados con DT y un anticuerpo anti-PDL1. g, Esquema experimental. h, curvas de crecimiento tumoral medio (n = 9 o 10 ratones por grupo; ****P < 0,0001). i, j, análisis de tumor KPR subcutáneo 12 días después del tratamiento que muestra la cuantificación de la frecuencia de células T granzima B+ CD8+ (n = 10 ratones) (i) y TNF+IFNγ+granzima B+ células T CD8+ (n = 10 ratones) (j) . k–m, Los datos son de ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR pancreáticos ortotópicos tratados con DT y un anticuerpo anti-PDL1 k, Esquema experimental. l, Curvas de crecimiento tumoral promedio (n = 7 ratones por grupo). El eje x representa los días posteriores a la implantación. m, peso del tumor el día 24 después de la implantación (n = 5 ratones). Los datos en b–f, h–j, l y m son la media ± sd Los datos en b, h, d y f son representativos de dos experimentos independientes y l y m son representativos de un experimento independiente. Los datos en c, e, I y j se combinan a partir de dos experimentos independientes. Las estadísticas se calcularon mediante el análisis ordinario de una vía de la prueba de varianza (b,f,h–j,l,m) o la prueba t de Student no pareada de dos colas (c,d,e). Los valores de significancia marcan el grupo de isotipo DTR++ en b y el grupo anti-PDL1 DTR++ en h con respecto a los otros tres grupos.

Datos fuente

Para comprender los efectos farmacodinámicos del agotamiento de LRRC15+ CAF en la función de las células T, utilizamos citometría de flujo para caracterizar el compartimento de células T CD8+ intratumorales 12 días después del agotamiento de CAF. No se observaron diferencias en el número total de células T CD8+ intratumorales entre los tumores con CAF suficiente y con deficiencia de CAF LRRC15+ (Fig. 4c). Sin embargo, en ausencia de CAF LRRC15+, las células T PD1+CD8+ exhibieron una expresión significativamente reducida de marcadores de superficie de moléculas asociadas con el agotamiento y la disfunción de las células T18,19, incluidas TIM3, LAG3 y CD39 (Fig. 4d). Además, observamos una mejora en la función de las células T CD8+, como se muestra por el aumento de la expresión de TNF e IFNγ (Fig. 4e).

El análisis de inmunofluorescencia de los tumores KPR reveló una proporción significativa de células T CD8+ que infiltran el tumor muy cerca de los CAF LRRC15+, lo que sugirió que se estaban produciendo interacciones directas de célula a célula (Datos ampliados, Fig. 6b). Esto nos llevó a preguntarnos si los CAF LRRC15+ pueden influir directamente en el potencial de las células T efectoras. LRRC15+ y LRRC15– CAF de tumores DTR– o PDPN+ LRRC15 agotados CAF de tumores DTR+ se clasificaron 12 días después del tratamiento con DT. Luego, estos se cocultivaron individualmente con células T CD8 + esplénicas en presencia de anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Datos extendidos Fig. 6c, d). Tres días después, se volvieron a estimular las células T CD8+ y se evaluó la expresión de las proteínas TNF e IFNγ. En comparación con las células T CD8+ solas, la expresión de TNF e IFNγ se redujo significativamente en presencia de CAF LRRC15+, mientras que la función de las células T no se modificó en presencia de CAF LRRC15– o las CAF normalizadas sin LRRC15 (Fig. 4f). Estos resultados demuestran un papel para los CAF LRRC15+ en la represión de la función de las células T CD8+ intratumorales y muestran que los CAF LRRC15+ pueden limitar directamente el potencial efector de las células T CD8+.

Trabajos anteriores han demostrado que el agotamiento de miofibroblastos FAP+ en modelos de cáncer puede mejorar la capacidad de respuesta anti-PDL120. Queríamos probar si se observan efectos similares después de la ablación CAF LRRC15+. A los ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR subcutáneos y tratados con DT se les administró un anticuerpo anti-PDL1 o de control de isotipo, y se evaluó el crecimiento del tumor (Fig. 4g). Los ratones con suficiente CAF para LRRC15+ mostraron cierta sensibilidad al tratamiento anti-PDL1, como lo demuestra una reducción parcial de la carga tumoral. Por el contrario, la capacidad de respuesta al tratamiento anti-PDL1 se potenció significativamente en ratones con reducción de CAF LRRC15+, como se refleja en la reducción más sustancial de la carga tumoral. (Fig. 4h y Datos extendidos Fig. 6e). Esta configuración de combinación no solo mejoró el control del tumor, sino que también condujo a un beneficio de supervivencia significativo, medido por el tiempo hasta la progresión de los tumores (Datos ampliados, Fig. 6f). El análisis de citometría de flujo del compartimento de células T CD8+ 12 días después del tratamiento anti-PDL1 con depleción de LRRC15+ CAF reveló un aumento en su potencial citolítico, medido por la expresión de granzima B. La frecuencia de células T polifuncionales también aumentó, como se refleja en el número de células T TNF + IFNγ + granzima B + CD8 + (Fig. 4i, j).

A continuación, preguntamos si la ausencia de CAF LRRC15+ mejoraba la capacidad de respuesta al tratamiento anti-PDL1 en los tumores KPR que crecían en el páncreas. Las células tumorales KPR se implantaron ortotópicamente en el páncreas de ratones DTR– o DTR+. El día 7 después de la implantación, se inició el tratamiento con DT en combinación con el anticuerpo anti-PDL1 o un control de isotipo, y se midió la carga tumoral mediante imágenes de ultrasonido (Fig. 4k y datos extendidos, Fig. 7a). De manera similar a los tumores subcutáneos, la ablación de CAF LRRC15+ en tumores pancreáticos ortotópicos mejoró significativamente el control tumoral y se sinergizó con anti-PDL1 para reducir aún más la carga tumoral (Fig. 4l y Datos extendidos Fig. 7b). Los tumores recolectados el día 24 de ratones DTR+ tratados con anti-PDL1 mostraron pesos tumorales significativamente más bajos que los ratones de control, lo que reflejó la cinética del volumen tumoral observada durante el tratamiento (Fig. 4m). Además, los tumores pancreáticos DTR+, ya sea que se trataran con anti-PDL1 o control de isotipo, mostraron una ablación casi completa de los CAF LRRC15+ y una reducción significativa en el compartimento total de fibroblastos PDPN+ (Datos extendidos Fig. 7c-e). Juntos, estos hallazgos muestran que el agotamiento terapéutico de los CAF LRRC15+ del microambiente del tumor pancreático conduce a una respuesta marcadamente mejorada al tratamiento con ICB anti-PDL1.

En este estudio, proporcionamos evidencia genética directa de que la señalización de TGFβ en fibroblastos universales DPT+ promueve la formación de miofibroblastos LRRC15+ durante la tumorigénesis, lo que constituye un eje central de fibroblastos en múltiples cánceres humanos. El agotamiento selectivo de CAF LRRC15+ redujo notablemente el contenido total de fibroblastos y revirtió este compartimento estromal a un estado similar a fibroblastos universal. A su vez, esto mejoró la función efectora de las células T CD8+ intratumorales y potenció la capacidad de respuesta anti-PDL1.

La utilidad de LRRC15 como un marcador altamente restringido para este subconjunto de miofibroblastos nos permitió investigar directamente su papel en la formación de la TME sin perturbar los fibroblastos en otros tejidos, como los LN, donde la arquitectura del tejido y el cebado y la función de las células T están determinados por el fibroblasto local. red16,21. Los análisis de tumores con reducción de CAF en LRRC15+ revelaron que la actividad similar a los fibroblastos universales estaba enriquecida, pero sin una ablación sostenida, los miofibroblastos LRRC15+ pueden reponerse y restablecer su punto de apoyo en el compartimento de CAF. Estos datos resaltan la relación de 'tirar y empujar' que tienen los CAF LRRC15+ con los fibroblastos universales para establecer un punto de ajuste de fibroblastos tumorales que finalmente suprime la inmunidad de las células T antitumorales y la eficacia de la terapia ICB. Desde el punto de vista inmunológico, se justifica una mayor investigación para comprender la naturaleza de la relación entre las células T CD8+ y los CAF LRRC15+ que conduce a su supresión funcional. Además, será importante comprender si los CAF LRRC15+ dictan la capacidad de respuesta de ICB de manera similar en diferentes indicaciones y fenotipos inmunes a tumores.

Terapéuticamente, nuestros hallazgos plantean la cuestión de la estrategia óptima para modular la actividad de LRRC15+ CAF. El uso de inhibidores de TGFβ, que actualmente se están evaluando en múltiples ensayos clínicos22, es una opción terapéutica atractiva para impedir la formación de CAF LRRC15+. Sin embargo, la eliminación de la señalización de TGFβ en los precursores de DPT+ permitió un mecanismo compensatorio para mantener el número total de fibroblastos. Por el contrario, la ablación de LRRC15+ CAF redujo notablemente la celularidad de los fibroblastos en el TME. Si el entorno óptimo para una respuesta inmunitaria antitumoral eficaz requiere un compartimento CAF que sea más pequeño y sin CAF LRRC15+, nuestros datos sugieren claramente que agotar los CAF LRRC15+ en sí puede ser una estrategia terapéutica más atractiva para generar respuestas robustas y duraderas contra el cáncer inmunoterapia Además, la presencia de miofibroblastos LRRC15+ en otras enfermedades no neoplásicas, como la fibrosis pulmonar idiopática y la colitis ulcerosa10, sugiere que dicho enfoque terapéutico puede ampliarse para proporcionar beneficios al paciente en otras áreas de la enfermedad.

Los ratones DptIresCreERT210 y Lrrc15DTRGFP fueron diseñados, generados y criados en Genentech. Los ratones Tgfbr2fl/fl (012603) se obtuvieron del Laboratorio Jackson. Se utilizaron ratones de la misma edad y sexo (de 6 a 12 semanas de edad) para todos los estudios. Los ratones se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos siguiendo las pautas de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. Los tamaños de muestra para cada estudio se describen en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en Genentech.

Se utilizaron recombinación homóloga y tecnología de células madre embrionarias de ratón (ES)23,24,25 para generar una cepa de ratón modificada genéticamente con Lrrc15 DTR-GFP activado. Se construyó un vector dirigido a genes con un brazo de homología 5′ de 1704 pb correspondiente a GRCm38/mm10 cromosoma 16: 30274520–30276223 y un brazo de homología 3′ de 1994 pb correspondiente al cromosoma 16: 30270786–30272779. La eliminación del exón 2 después de ATG corresponde al cromosoma 16: 30,272,780–30,274,516. DTR-EGFP-SV40-FRT-PGK-neo-FRT se insertó inmediatamente después de ATG del exón 2. El vector final se confirmó mediante secuenciación de ADN, se linealizó y se utilizó para detectar células ES C2 (C57BL/6N) utilizando métodos estándar (G418+ y selección de ganciclovir)26 C57BL/6N C2 Células ES27 se sometieron a electroporación con 20 µg de ADN de vector de direccionamiento linealizado y se cultivaron bajo selección de fármacos esencialmente como se describió anteriormente28. Los clones positivos se identificaron mediante PCR de largo alcance seguida de confirmación de secuencia. Las células ES dirigidas correctamente se sometieron a cariotipo. Los clones de células ES dirigidas al gen euploid se trataron con Adeno-FLP para eliminar la neomicina PGK, y los clones de células ES se analizaron para identificar clones sin copias del casete de neomicina PGK, y se verificó la secuencia correcta del alelo objetivo. La presencia del cromosoma Y se verificó antes de la microinyección en embriones albinos Bl/6N. La transmisión de línea germinal se obtuvo después de cruzar las quimeras resultantes con hembras C57BL/6N. El ADN genómico de las crías se analizó mediante PCR de largo alcance para verificar la estructura dirigida al gen deseada antes de la expansión de la colonia de ratones. Para el genotipado, se usaron los siguientes cebadores: 5′-AGGCGAGGCGATTG-3′, 5′-CGATGAGGGCTGAAATGT-3′ y 5′-TGGTCCGTGGATACAGT-3′ amplificados de 408 pb de tipo salvaje y fragmentos de ADN de 313 pb knock-in. Se utilizó el siguiente ciclo de PCR: 94 °C por 4 min, (94 °C por 1 min, 55 °C por 30 s, 72 °C por 1 min) por 30 ciclos; 72 °C durante 10 min; 4 °C hasta el infinito.

La línea celular de adenocarcinoma pancreático de ratón KPR fue generada por Junttila Group en Genentech a partir de KPR PDAC GEMM (KrasLSL.G12D/wt;p16/p19fl/wt;p53LSL.R270H/wt;Pdx1.Cre)11. Las células KPR se cultivaron en RPMI con FBS al 10 % (Hyclone) más 2 mmol l–1 l de glutamina. Todas las líneas celulares se analizaron para la contaminación por Mycoplasma mediante PCR cuantitativa (Lonza Mycoalert y Stratagene Mycosensor). Para todos los tumores inyectados, se usaron células dentro de los primeros tres pases.

Para los tumores KPR subcutáneos, las células KPR se tripsinizaron, filtraron, contaron y resuspendieron en una mezcla 1:1 de solución salina tamponada de Hanks y Matrigel sin rojo fenol (Corning) a una concentración de 1 × 106 células ml–1. Para todos los genotipos de ratones utilizados, ratones de 6 a 12 semanas de edad de la misma edad y sexo se inocularon por vía subcutánea en el flanco unilateral derecho con 1 × 105 células tumorales KPR. El vello de la piel de los flancos se afeitó antes de la implantación. Los volúmenes tumorales se midieron y calcularon 2 o 3 veces por semana utilizando la siguiente fórmula elipsoide modificada: ½ × (largo × ancho2). Los tumores >1000 mm3 se consideraron avanzados y los animales se retiraron del estudio. De manera similar, los animales cuyos tumores se ulceraron más de 5 mm se eliminaron del estudio. Para los estudios de tumores subcutáneos en ratones Lrrc15DTRGFP, cuando los tumores alcanzaron un volumen de 100 a 200 mm3 (alrededor de 10 días después de la inoculación), los animales se distribuyeron en grupos de tratamiento en función del volumen del tumor y se inició el tratamiento.

Para los tumores KPR pancreáticos ortotópicos, la inyección de células tumorales pancreáticas en el páncreas de los ratones se realizó como se describió previamente29. Las células KPR se resuspendieron en una mezcla 1:1 de solución salina tamponada de Hanks y Matrigel sin rojo fenol (Corning) a una concentración de 2 × 105 o 2 × 106 células ml–1. Los ratones DptCreERT2Tgfbr2fl/fl o Lrrc15DTR se anestesiaron con anestesia inhalatoria, se colocaron sobre una almohadilla térmica y se les administró gel para colirio. El flanco izquierdo o región abdominal se afeitó y esterilizó con ChloraPrep (BD) antes de realizar una incisión de aproximadamente 1 cm con microtijeras estériles medial a la silueta esplénica. Se hizo una incisión en la capa muscular subyacente y se usaron fórceps de punta roma para exteriorizar el páncreas y el bazo. Se insertó una aguja de calibre 31 preparada que contenía la solución de células en la cola del páncreas y se inyectaron lentamente 50 µl de solución que contenía 1 × 105 células. La herida se cerró usando suturas absorbibles y clips para heridas y se permitió que los ratones se recuperaran. A todos los animales se les administró el analgésico de liberación lenta buprenorfina SR LAB a 0,5 mg kg–1. Los ratones se monitorearon todos los días después del procedimiento quirúrgico para detectar signos de infección o angustia. Para los estudios de tumores ortotópicos en ratones Lrrc15DTRGFP, 7 días después de la implantación, los animales se distribuyeron en grupos de tratamiento sobre la base del volumen del tumor y se inició el tratamiento.

Los ratones se recolectaron en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento para su análisis o se usaron para estudios de crecimiento tumoral. Los tamaños de las muestras en los estudios con ratones se basaron en el número de ratones que se necesitaban de forma rutinaria para establecer la significación estadística en función de la variabilidad dentro de los grupos de estudio. Los grupos de tratamiento se cegaron cuando fue posible. Todos los estudios en animales aquí descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Genentech.

Para los estudios de tumores pancreáticos ortotópicos en ratones Lrrc15DTRGFP, los volúmenes de los tumores se midieron mediante imágenes por ultrasonido. Los ratones se anestesiaron con sevoflurano al 4 % (Zoetis) en una caja de inducción caliente y se colocaron sobre su lado derecho bajo un flujo continuo de sevoflurano al 2,5–3 % durante la obtención de imágenes. Después de la depilación, se colocó gel de acoplamiento de ultrasonido sobre la piel y se adquirieron imágenes anatómicas en modo B en vevo2100 (Fujifilm VisualSonics-) en planos transversales y longitudinales, capturando las secciones transversales máximas del tumor (sonda MS-550D; frecuencia central de 40 MHz, resolución axial de 40 µm, resolución lateral de 90 µm y profundidad de campo de 12 mm). El volumen del tumor pancreático por ratón se analizó mediante Vevo LAB v.5.5.1 con la siguiente fórmula para un elipsoide: volumen (mm3) = π/6 × largo × ancho × profundidad.

Para la expresión de Cre inducida por TAM, a los ratones se les inyectaron 2 mg de TAM (Sigma, T5648) diluidos en aceite de semilla de girasol (Sigma, 88921) durante cinco días consecutivos por vía intraperitoneal o se les alimentó con comida que contenía TAM (Envigo, TD.130859). Para la ablación de LRRC15 CAF, a los ratones se les inyectaron por vía intraperitoneal 25 ng g–1 de DT (Enzo Life Sciences, BML-G135) dos veces por semana. Para los estudios de depleción de CD8, los ratones se trataron con anticuerpos de control de isotipo IgG2b de rata o anticuerpos de depleción de IgG2b anti-CD8 de rata (BioXcell, BE0061) a una dosis de 10 mg kg–1 administrada por vía intraperitoneal tres veces por semana. Para los estudios anti-PDL1, los ratones se trataron con anticuerpos de control de isotipo o anticuerpos anti-PDL1 (6E11) (internos). La primera dosis se administró a 10 mg kg–1 seguida de 5 mg kg–1 a partir de entonces administrada por vía intraperitoneal dos veces por semana.

Los tumores se recogieron, pesaron y trituraron en trozos pequeños. Para aislar la piel del flanco virgen, se afeitó el cabello, se eliminó el tejido adiposo y se picó el tejido de la piel. Posteriormente, todos los tejidos se digirieron enzimáticamente utilizando un cóctel de dispasa (Life Technologies), colagenasa P y DNasaI (Roche) durante 45 min a 37 °C para obtener una suspensión unicelular. Las células se contaron utilizando un Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Para la tinción de citoquinas, las suspensiones celulares se estimularon con eBioscience Cell Stimulation Cocktail más inhibidores del transporte de proteínas (00-4975-93) resuspendidas en RPMI con 10% FBS más 2 mmol l–1 l-glutamina y 2-mercaptoetanol durante 2 h a 37 ° C. Las células se marcaron con los siguientes anticuerpos monoclonales adquiridos de BioLegend o BD Biosciences a 4 ºC en hielo durante 20 a 30 min, a menos que se indique lo contrario. Antes de teñir la superficie celular con los siguientes anticuerpos marcados con fluorescencia, las células se bloquearon con bloque Fc (2.4G2; 1:200, 553142). Se utilizaron los siguientes anticuerpos de superficie o intracelulares: CD45 (30-F11, 103139); EPCAM (G8.8, 118218); CD31 (390, 561410); PDPN (8.1.1, 127410); CD24 (M1/69, 612832); LRRC15 (M25, interno); CD90.2 (53-2.1, 565527); CD8 (53-6,7, 612759); PD1 (29F.1A12, 135225); TIM3 (RMT3-23, 119727); LAG3 (C9B7W, 125227); CD39 (Duha59, 143812); IFNγ (XMG1.2, 505846); granzima B (GB11, 515408); y TNF (MP6-XT22, 506324). Las células vivas se identificaron mediante incubación con azul de calceína (Invitrogen, C1429, 1:1000) después de la tinción superficial. Para la tinción intracelular, las muestras se fijaron, permeabilizaron y tiñeron usando un kit de fijación/permeabilización BD Cytofix/Cytoperm (554714) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se adquirieron con un citómetro de flujo Fortessa, Symphony o LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con FlowJo (Tree Star, v.10.7.1), o las células se clasificaron con Fusion o Aria (BD Biosciences). Los datos del instrumento se procesaron utilizando Prism GraphPad. Se proporciona información adicional en la Tabla complementaria 6.

Para la estimulación con anti-CD3 unido a la placa, se recubrieron placas de fondo plano de 96 pocillos durante la noche a 4 °C con 10 µg ml–1 de anti-CD3 (BioLegend, 100340, clon 145-2C11) y se lavaron una vez con PBS. Los CAF primarios relevantes se clasificaron a partir de tumores subcutáneos KPR digeridos de ratones DTR– o DTR+, y luego se agregaron 3 × 104 células al pocillo recubierto con anti-CD3 (100 µl). Las células se incubaron durante 1 h a 37 °C para facilitar la unión. Durante la incubación, se aislaron células T CD8+ de ratón a partir de una suspensión de células individuales de esplenocitos vírgenes mediante selección inmunomagnética negativa utilizando un kit de enriquecimiento de células T CD8+ de ratón EasySep de Stem Cell (19853) de acuerdo con las directrices del fabricante. Se añadieron a los pocillos aproximadamente 6 × 104 células T CD8+ purificadas en presencia de 0,50 µg ml–1 de anti-CD28 soluble (BioLegend, 102115, clon 37.51) (100 µl). El día del análisis, se reemplazó el medio y las células se cultivaron con 1x Cóctel de estimulación celular (eBioscience 500x Cóctel de estimulación celular más inhibidores del transporte de proteínas, 00-4975) y 2-mercaptoetanol 55 µM durante 4 h a 37 °C. Las células se recogieron, filtraron y tiñeron para marcadores de superficie. Después de la tinción de la superficie, las células se fijaron y permeabilizaron con el conjunto de tampones de permeabilización y fijación intracelular de acuerdo con las pautas del fabricante antes de la tinción para las citocinas intracelulares. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Los tumores se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 % y se incluyeron en un medio de temperatura de corte óptimo (Sakura Finetek) y se congelaron para su almacenamiento a -80 °C. Las secciones (de 8 a 12 μm de espesor) se crioseccionaron y se tiñeron. Para la tinción, los portaobjetos se bloquearon y permeabilizaron con suero de ratón normal (1:50), bloque Fc de ratón (1:100) y Triton-X al 0,3 % diluido en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Después del lavado, se añadieron anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Para contrateñir, los portaobjetos se enjuagaron y se incubaron con DAPI (ThermoFisher, D1306) a 300 nM en PBS durante 5 min a temperatura ambiente. Los detalles de los anticuerpos utilizados se pueden encontrar en la Tabla complementaria 6. Los portaobjetos se enjuagaron varias veces en PBS, se drenó el exceso de tampón y las secciones se montaron en Vectashield (H-1000). Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal Nikon A1R equipado con una lente Plan apo lambda NA 0.75 × 20. Los láseres se ajustaron a la excitación a 488 nm, 561 nm y 640 nm, y un módulo de enfoque perfecto. Se usó el software de adquisición NIS Elements con un zoom digital de 2 para obtener imágenes de secciones completas de tejido o 7 para detalles, y se realizó la unión de imágenes de un solo plano. Se compilaron estimaciones de las tasas de interacción de las células T CD8-LRRC15 CAF entre las células T y las CAF observadas entre las células T totales en una sección de tejido de 500 × 500 × 10 µm3 en 3 tumores diferentes.

Los tejidos para la hibridación in situ se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina. La hibridación in situ de LRRC15 de ratón se realizó con una sonda ACD (Advanced Cell Diagnostics, 467838 con 120 min de hibridación. La recuperación de ER2 (Leica) a 95 °C durante 15 min y la digestión con RNAscope 2.5 LS Protease III (ACD) se realizó en un Leica Bond Se utilizó el kit de reactivos rojo (ACD) RNAscope 2.5 LS para la detección.

El scRNA-seq de ratón y el hash celular con anticuerpos únicos con código de barras (BioLegend) se procesaron utilizando la biblioteca Chromium Single Cell Gene Expression 3′ v3 y un kit de perlas de gel siguiendo las instrucciones del fabricante (10x Genomics, PN-1000075). Se contaron las células y se comprobó su viabilidad usando un contador de células Vi-CELL XR (Beckman Coulter), y luego se inyectaron en chips de microfluidos para formar perlas de gel en emulsión en un instrumento de cromo 10x. Se realizó la transcripción inversa en las perlas de gel en emulsión y los productos se purificaron y amplificaron. El ADN de las etiquetas derivadas de anticuerpos se separó del ADNc en función de la selección de tamaño utilizando perlas SPRIselect (Beckman Coulter, B23318). Las bibliotecas de expresión y las bibliotecas de etiquetas derivadas de anticuerpos se generaron y perfilaron utilizando un kit de ADN de alta sensibilidad Bioanalyzer (Agilent Technologies, 5067-4626) y se cuantificaron con un kit de cuantificación de biblioteca Kapa (Roche, 07960255001). Todas las bibliotecas se secuenciaron utilizando HiSeq4000 y NovaSeq (Illumina)

Los datos de scRNA-seq para cada biblioteca de cada tipo de célula se procesaron con el recuento de CellRanger (CellRanger 3.1, 10x Genomics) con una referencia personalizada basada en el genoma de referencia del ratón GRCm38 y los modelos genéticos GENCODE. Los recuentos de anticuerpos de código de barras para etiquetar réplicas individuales se procesaron utilizando DemuxEM con parámetros predeterminados para asignar etiquetas de muestras individuales30. Las células identificadas como dobletes o células negativas para HTO se excluyeron del análisis. Para los recuentos de expresión génica, las muestras individuales se fusionaron en una matriz de expresión y se analizaron utilizando el paquete Seurat. Se eliminaron las células con menos de 300 genes expresados ​​o más del 5 % de recuentos mitocondriales. Los recuentos de transcripciones se normalizaron logarítmicamente (Seurat, NormalizeData) y los 2000 genes más variables se seleccionaron mediante la transformación de estabilización de la varianza (FindVariableFeatures), seguida de la escala de datos (ScaleData). Luego se realizó PCA en este espacio genético (RunPCA). El agrupamiento se llevó a cabo sobre la base del vecino más cercano compartido entre celdas (FindNeighbors, 30 PC) y el agrupamiento basado en gráficos (30 PC, resolución de 0,1 para el agotamiento de Lrrc15, 0,5 para experimentos Tgfbr2 KO). Calculamos marcadores para grupos individuales utilizando la función FindMarkers en Seurat (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, ajuste de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples). Para visualizar los niveles de expresión génica para grupos individuales, calculamos la expresión génica promedio en cada grupo y calculamos un valor de puntuación z por gen.

Para los experimentos DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl, las células del objeto Seurat resultante del paso inicial de procesamiento de datos se filtraron más en función de la expresión de marcadores de tipo celular conocidos. Solo las células de fibroblastos de los grupos 0, 2, 3, 4, 5 y 8 que expresan Lum y Dcn, pero no Pecam1 (células endoteliales), Ptprc (células inmunes) o Rgs5 (pericitos), se conservaron para análisis posteriores. Luego realizamos la reducción de la dimensionalidad y el agrupamiento como se describe anteriormente y eliminamos las células no fibroblásticas contaminantes menores restantes. La reducción de dimensionalidad final y el agrupamiento se realizaron utilizando 30 PC y una resolución de agrupamiento de 0,3.

Para los experimentos de agotamiento de Lrrc15DTRGFP, las células de fibroblastos (grupos 0, 1, 2 y 5) en el objeto Seurat resultante del paso inicial de procesamiento de datos se aislaron excluyendo los grupos que expresan Pecam1 (células endoteliales), Ptprc (células inmunitarias), Rgs5 ( pericitos), Krt18 (epitelial) o Myl1 (células del músculo liso). Luego realizamos la reducción de la dimensionalidad y el agrupamiento como se describe anteriormente y eliminamos las células no fibroblásticas contaminantes menores restantes. La reducción de dimensionalidad final y el agrupamiento se realizaron utilizando 30 PC y una resolución de agrupamiento de 0,2.

Las células se puntuaron para los programas de expresión génica utilizando la función addModuleScore en Seurat y un conjunto de genes de interés como entrada. Los programas GEMM de ratón PDAC se derivaron de la siguiente manera. Utilizamos genes con al menos 0,6 de media de regulación al alza del cambio de pliegue logarítmico en CAF de TGFβ (grupo 2) de nuestro estudio anterior1 como genes marcadores para estas afecciones. Para identificar un conjunto de genes de fibroblastos de tejido normal (grupos 3 y 4), identificamos los 20 marcadores principales para los grupos 3 y 4 y los comparamos con todas las demás células en el conjunto de datos utilizando la función FindMarkers en Seurat.

Para evaluar las diferencias en la abundancia de células de grupos específicos entre condiciones, usamos el paquete R speckle (https://github.com/Oshlack/speckle), que está diseñado para encontrar diferencias significativas en las proporciones de tipo de célula. En resumen, speckle calcula la fracción de células asignadas a un grupo particular en cada réplica biológica, realiza una transformación estabilizadora de varianza en las proporciones y determina si las proporciones de tipo de célula son significativas entre diferentes grupos. Dado que solo comparamos dos grupos en todos nuestros experimentos, el moteado utilizó la prueba t para calcular los valores de P, que se ajustaron para pruebas múltiples utilizando la corrección de Benjamini-Hochberg.

Usamos PROGENy17 para inferir la actividad de la vía a partir de nuestros datos de expresión génica de una sola célula como se describió anteriormente10 y siguiendo el tutorial de una sola célula proporcionado por los autores (https://saezlab.github.io/progeny/articles/ProgenySingleCell.html). Emparejamos las puntuaciones de la progenie con grupos o con el punto/condición de tiempo experimental y resumimos los datos por población.

Los fragmentos normalizados por kilobase de secuencia por millón de valores de lectura mapeados se recuperaron de la Tabla complementaria 6 en la ref. 12. Los datos se transformaron logarítmicamente y los niveles de expresión de Lrrc15 y Gapdh se visualizaron por tejido.

Los datos de ARNm de Pan-Cancer TCGA normalizados corregidos por lotes se obtuvieron de UCSC Xenabrowser (https://xenabrowser.net/) (N = 11,060). Se eliminaron las muestras que contenían valores de expresión de NA. Además, filtramos los datos para que solo contengan muestras de tumores sólidos primarios (código de muestra 01; N = 9702). Los datos de supervivencia se obtuvieron de la Tabla S1 en la ref. 31 y vinculado al conjunto de datos de Pan-Cancer utilizando el código de barras único de participante de TCGA. Se excluyeron del análisis las indicaciones con menos de 80 pacientes (conjunto de datos final: N = 9195 pacientes). Los niveles de CAF de TGFB se infirieron calculando la expresión promedio de nuestra firma de marcador publicada previamente1 dentro de una muestra después de la transformación de la puntuación z de cada gen en las muestras. La asociación con la supervivencia en los datos de TCGA se determinó con la regresión de Cox multivariable y la indicación de TCGA como covariable, así como con el análisis de regresión de Cox univariable dentro de cada indicación. El cociente de riesgos instantáneos se definió como el cambio en el riesgo de muerte si la puntuación TGFβ CAF aumentaba una unidad.

Las muestras de tumores para la Iniciativa Immunoprofiler (IPI) se transportaron desde varios quirófanos de cáncer y desde clínicas ambulatorias. Todos los pacientes dieron su consentimiento al grupo de coordinadores clínicos IPI de la Universidad de California, San Francisco (UCSF) para la recolección de tejido bajo un protocolo de UCSF aprobado por la junta de revisión institucional (UCSF IRB 20-31740). Las muestras se obtuvieron después de la escisión quirúrgica con biopsias tomadas por asistentes de patología para confirmar la presencia de células tumorales. Los pacientes fueron seleccionados sin tener en cuenta el tratamiento previo. Las muestras recién resecadas se colocaron en medio PBS helado o medio L-15 de Leibovitz en un tubo cónico de 50 ml y se transportaron inmediatamente al laboratorio para el etiquetado y procesamiento de las muestras. Las muestras se usaron para la digestión de todo el tejido en una suspensión unicelular o se cortó una parte del tejido y se conservó para el análisis de imágenes.

La clasificación de células, la preparación de bibliotecas, la secuenciación y el procesamiento de datos bioinformáticos se realizaron como se describió anteriormente32.

A partir de la matriz transformada logarítmica de los valores de expresión de gen x célula normalizados, identificamos los 2500 genes más variables en función de su rango intercuartílico y realizamos PCA en el espacio de estos genes. Luego usamos los 10 genes de carga positiva y negativa más fuertes de PC1-PC6 para la agrupación jerárquica de muestras y genes (vinculación completa y distancia euclidiana). El dendrograma de conglomerados se dividió en k = 6 conglomerados según la altura del árbol. Interpretamos grupos de muestras con alta expresión de EPCAM, KRT8 y KRT18 como impulsados ​​por epitelio y TYROBP y CSF3R como impulsados ​​por mieloide y excluimos estas muestras de nuestro análisis posterior. A continuación, realizamos PCA en las muestras restantes. Las cargas del espacio de PC resultante se usaron luego para proyectar las muestras impulsadas por epitelio y mieloide en PC1 y PC2. De manera similar, las muestras de secuencias de ARN a granel microdisectadas de pacientes con PDAC como se proporciona en la ref. 33 se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (identificador GSE93326) y se proyectaron en PC1 y PC2.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos scRNA-seq sin procesar y procesados ​​están disponibles en el repositorio de ArrayExpress con los números de acceso E-MTAB-12028 y E-MTAB-12036. Los datos de RNA-seq a granel de células estromales humanas están disponibles en la base de datos del Archivo Europeo de Genomas y Fenómenos con el acceso EGAD00001009176. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

No se desarrollaron nuevos algoritmos para este manuscrito. Todo el código generado para el análisis está disponible a pedido de los autores.

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Agradecemos a los miembros del Laboratorio de Turley por la discusión y la asistencia experimental y al personal de las instalaciones de Genentech por el mantenimiento del vivero y la asistencia de las instalaciones centrales. La adquisición y los análisis de ciertas muestras humanas descritas en este estudio fueron realizados por UCSF y financiados parcialmente por contribuciones de AbbVie, Amgen, Bristol-Myers Squibb, Genentech y Pfizer como parte del IPI de UCSF. Las ilustraciones de ratones, humanos y células se crearon con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por Genentech.

Genentech, Sur de San Francisco, CA, EE. UU.

Akshay T. Krishnamurty, Justin A. Shyer, Minh Thai, Vineela Gandham, Matthew B. Buechler, Yeqing Angela Yang, Rachana N. Pradhan, Amber W. Wang, Patricia L. Sanchez, Yan Qu, Beatrice Breart, Cécile Chalouni, Debra Dunlap, James Ziai, Justin Elstrott, Neelie Zacharias, Weiguang Mao, Rebecca K. Rowntree, Jack Sadowsky, Gail D. Lewis, Thomas H. Pillow, Barzin Y. Nabet, Romain Banchereau, Lucinda Tam, Roger Caothien, Natasha Bacarro, Merone Roose-Girma, Zora Modrusan, Sanjeev Mariathasan, Sören Müller y Shannon J. Turley

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Conceptualización: ATK, S. Müller. y Metodología SJT: ATK, S. Müller. y SJT Software, análisis formal y curación de datos: AWW y S. Müller. Investigación: ATK, JAS, MT, VG, MBB, YAY, RNP, PLS, YQ, BB, CC, DD, JZ, JE, NZ, WM, RKR, JS, GDL, THP, BYN, RB, LT, RC, NB, MR-G., ZM y S. Mariathasan. Redacción: ATK, S. Müller. y Visualización SJT: ATK, MT, CC, RNP, JZ y S. Müller. Supervisión: S. Müller. y SJT

Correspondencia a Sören Müller o Shannon J. Turley.

Todos los autores son empleados de Genentech Inc., miembro del grupo Roche.

Nature agradece a Mara Sherman y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a. De tumores KPR subcutáneos 21 días después de la implantación en ratones Dptwt/wtRosa26LSLYFP+/- y Dptki/kiRosa26LSLYFP+/- que muestran gráficos de citometría de flujo representativos (izquierda) y cuantificación de la frecuencia (derecha) de células Dpt-YFP+ en fibroblastos PDPN+CD31– (n = 6 ratones). bi. De tumores KPR subcutáneos 21 días después de la implantación en ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl y Dptki/kiTgfbr2fl/fl después del régimen experimental de la Fig. 1a que muestra b. Histograma de citometría de flujo representativo (izquierda) y cuantificación de la frecuencia (derecha) de células TGFβR2+ en fibroblastos PDPN+CD31– (n = 10 ratones). C. Estrategia representativa de activación previa a la clasificación (izquierda) y análisis de pureza posterior a la clasificación (derecha) de células estromales CD24-CD45- y células inmunitarias CD45+ d. Gráfica UMAP de 10 136 estroma y células inmunitarias coloreadas por pertenencia al grupo (izquierda), expresión génica marcadora (centro) y frecuencia de muestras de hash de células individuales en grupos de UMAP (n = 5 ratones por grupo). mi. Gráficos de violín que muestran la puntuación de una firma del gen Tgfb CAF PDAC GEMM para las células en cada grupo de la Fig. 1e. f, g. UMAP como en la Fig. 1f, coloreados por la expresión de los marcadores indicados. H. Fracción de células en cada grupo de cada condición de la Fig. 1e (n = 5 animales por condición). i. Puntuaciones para el mismo conjunto de genes que en e, aquí para células en el grupo en proliferación (C4) de la Fig. 1e y divididas por condición. Los datos en a,b se agrupan de dos o tres experimentos independientes. Los datos en a,b son la media +/− sd y en h son la media + sem Las estadísticas en a,b,h se calcularon utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas.

Datos fuente

a. Estrategia para el análisis de poblaciones de CAF clasificadas de tumores humanos: Izquierda: PCA se realizó en todas las muestras y se extrajeron los 20 genes de carga positiva y negativa más fuertes de cada PC. Medio: se realizó un agrupamiento jerárquico y se aislaron muestras sin contaminación. Derecha: PCA se realizó en estas muestras puras. Las muestras con algunas contaminaciones se proyectaron en este espacio PCA obtenido de muestras puras para derivar la Fig. 1l. b. Distribución de tejidos normales adyacentes (N) y tumorales (T) a lo largo de PC1 de la Fig. 1l. C. Proyección de 123 muestras microdiseccionado PDAC RNA-seq en el espacio PCA obtenido en la Fig. 1b. d. El mismo diagrama de bosque que en la Fig. 1p, aquí para todas las indicaciones de cáncer en TCGA. En los datos de b, c, los bigotes representan el mínimo y el máximo, el cuadro representa IQR y la línea central representa la mediana. En los datos de d, el punto central muestra la razón de riesgo y las líneas representan el intervalo de confianza del 95 %. Las estadísticas se calcularon utilizando un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox en d.

Datos fuente

a. Cuantificación de la frecuencia de células LRRC15+ en tumores KPR subcutáneos 17 días después de la implantación en fibroblastos PDPN+, células endoteliales sanguíneas CD31+ (BEC), células estromales PDPN–CD31–, células inmunitarias CD45+ y células tumorales CD24+ (n = 10 ratones). b. Imágenes representativas de hibridación in situ de LRRC15 de tejidos murinos sanos seleccionados y tejido tumoral KPR subcutáneo 17 días después de la implantación. C. Datos de RNAseq a granel de 17 tejidos de ratón normales que muestran la expresión de Lrrc15 y Gapdh (control). El número de muestras por tejido está en los datos de origen. d.f. Expresión génica de Fap, Acta2 y Lrrc15 de d. Análisis de scRNAseq de fibroblastos, células inmunitarias, células endoteliales y pericitos de tumores KPR 21 días después de la implantación en ratones Dptwt/wtTgfbr2fl/fl. mi. scRNAseq de fibroblastos de estado estacionario Pdgfrα+ a través de tejidos murinos. F. scRNAseq de fibroblastos y pericitos de ganglios linfáticos murino que drenan la piel junto con la expresión de Ccl19. Los datos en a se agrupan a partir de tres experimentos independientes. Los datos en b son representativos de un experimento independiente. Los datos en a son la media +/− sd En los datos en c, los bigotes representan el mínimo y el máximo, el cuadro representa IQR y la línea central representa la mediana. Las estadísticas en a se calcularon usando una prueba ANOVA unidireccional ordinaria.

Datos fuente

a, b. De tumores KPR subcutáneos 8 días después del tratamiento con PBS o DT en ratones DTR– y DTR+. a. Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la frecuencia de células LRRC15+ en fibroblastos PDPN+CD31– y b. Cuantificación del número total de células PDPN+LRRC15+ normalizadas por el peso del tumor (n = 6 ratones) c. Cuantificación de la frecuencia de células PDPN+LRRC15+ (izquierda) y fibroblastos PDPN+CD31– (derecha) en los días 7 (n = 8 o 9 ratones), 14 (n = 10 ratones) y 21 (n = 10 ratones) después de DT tratamiento en ratones subcutáneos KPR portadores de tumores DTR– y DTR+. d. Curvas de cambio de peso corporal de ratones DTR– y DTR+ tratados con DT (n = 9 u 11 ratones/grupo). Cambio de peso corporal promedio en todos los animales (izquierda); Curvas de cambio de peso corporal individual por genotipo (derecha). El eje X representa los días posteriores al tratamiento con DT. Los datos en b, c se combinan a partir de dos o tres experimentos independientes. Los datos en d son representativos de tres experimentos independientes. Los datos en b, c, d son la media +/− sd Las estadísticas se calcularon utilizando una prueba ANOVA ordinaria de una vía en b y una prueba ANOVA ordinaria de dos vías en c.

Datos fuente

a. Estrategia representativa de activación previa a la clasificación (izquierda) y análisis de pureza posterior a la clasificación (derecha) de células estromales de tejido tumoral KPR subcutáneo (arriba) o tejido de piel ingenuo (abajo). b. Gráfica UMAP de 54,240 células estromales coloreadas por pertenencia al grupo (izquierda). UMAP como a la izquierda, aquí coloreado por la expresión génica del marcador indicado (centro) y la frecuencia de muestras de células individuales en grupos de UMAP (derecha). Expresión media relativa de los 5 genes marcadores principales en cada grupo (abajo). C. UMAP (D0,7,14,21; izquierda, D7,14,21; derecha) como en 3b dividida coloreada por la expresión de Cxcl12. d. Fracción de células en C1, C2 y C5 de la Fig. 3b en cada condición (n = 5 animales/condición) en los cuatro puntos temporales en muestras con tumores. mi. Gráficos de violín que muestran la puntuación de una firma genética C3/C4 de piel ingenua para las células de cada grupo en la Fig. 3b. F. Puntuaciones de enriquecimiento de la ruta PROGENY (color) para las células agrupadas para cada grupo en la Fig. 3b. Los datos en d son la media + sem Las estadísticas en d se calcularon utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas.

Datos fuente

a. Curvas de crecimiento tumoral individual de ratones DTR– y DTR+ con tumores KPR subcutáneos tratados con DT en combinación con control de isotipo o anticuerpo depletor de CD8 (n = 10 ratones/grupo). La línea roja discontinua representa el ajuste de referencia promedio del grupo de control (DTR– + isotipo). b. Análisis de inmunofluorescencia de tumores KPR subcutáneos teñidos para LRRC15 y CD8 (izquierda) y cuantificación de la frecuencia de células T CD8+ en una proximidad de menos de 2um de un CAF LRRC15+. cd. Esquema experimental (c) y estrategia de clasificación (d) para el experimento de cocultivo de células T CAF-CD8+ para obtener resultados en 4f. e, f. A partir de tumores subcutáneos KPR tratados con DT que contienen ratones DTR– y DTR+ en combinación con anticuerpo aPDL1 o control de isotipo e. Dos estudios independientes que muestran curvas de crecimiento de tumores individuales (Estudio 1: n = 9 o 10 ratones/grupo; Estudio 2: n = 9 u 11 ratones/grupo). La línea roja discontinua representa el ajuste de referencia promedio del grupo de control (DTR– + isotipo). F. Análisis de supervivencia del tiempo hasta la progresión a volúmenes tumorales que alcanzan los 1000 m3 o ulceración tumoral mayor de 5 mm (n = 9 o 10 ratones/grupo). Los datos en b son la media +/− sem. Los datos en a,f son representativos de dos experimentos independientes. Las estadísticas en f se calcularon utilizando una prueba de Mantel-Cox de rango logarítmico.

Datos fuente

a–e. A partir de tumores KPR pancreáticos ortotópicos tratados con DT que contienen ratones DTR– y DTR+ en combinación con anticuerpo aPDL1 o control de isotipo a. Imágenes de ultrasonido representativas de tumores KPR pancreáticos en todos los grupos de tratamiento y puntos de tiempo. La línea azul discontinua marca la circunferencia del tumor. b. Curvas de crecimiento de tumores individuales (n = 7 ratones/grupo). La línea roja discontinua representa el ajuste de referencia promedio del grupo de control (DTR– + isotipo). C. Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la frecuencia de células LRRC15+ en fibroblastos PDPN+CD31– d,e. Cuantificación del número total de células PDPN+LRRC15+ (d) y células PDPN+CD31+ (e) normalizadas por el peso del tumor (n = 5 ratones). Los datos en d,e son la media +/− sd Los datos en ae son representativos de un experimento independiente. Las estadísticas en d, e se calcularon usando una prueba ANOVA unidireccional ordinaria.

Datos fuente

Marcadores de todas las células para el experimento DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq.

Marcadores de fibroblastos para el experimento DptIresCreERT2Tgfbr2fl/fl scRNA-seq.

Información del paciente para la cohorte IPI.

Marcadores para todas las células del experimento cinético scRNA-seq Lrrc15DTR.

Marcadores para fibroblastos para el experimento cinético scRNA-seq Lrrc15DTR.

Información sobre los anticuerpos utilizados en este manuscrito.

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Reimpresiones y permisos

Krishnamurty, AT, Shyer, JA, Thai, M. et al. Los miofibroblastos LRRC15+ dictan el punto de referencia del estroma para suprimir la inmunidad tumoral. Naturaleza 611, 148–154 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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Recibido: 14 julio 2021

Aceptado: 24 de agosto de 2022

Publicado: 28 de septiembre de 2022

Fecha de emisión: 03 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05272-1

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